Was ist Methodenvalidierung?

 

Mit der Validierung einer analytischen Methode soll nachgewiesen werden, dass mit der Durchführung dieser Methode zu jedem Zeitpunkt und unabhängig von der ausführenden Person verlässliche und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Es wird der Beweis erbracht, dass die Methode für ihren Einsatzzweck geeignet ist.

Eine Methodenvalidierung ist nötig, wenn eine neue Methode nach der Etablierung in die Routine-Messung übergehen soll, sich in der praktischen Durchführung Aspekte geändert haben oder die Methode an einem anderen (räumlich entfernten) Standort angewendet werden soll. Dies ist bei Methodentransfers der Fall.

Damit bei Methodenvalidierungen wesentliche kritische Punkte berücksichtigt werden, gibt es regulatorische Vorgaben und anzuwendende Guidelines. Dazu zählt insbesondere die ICH Q2(R1). Diese Richtlinie „Validation of analytical procedures: text and methodology“, die von der International Conference on Harmonisation herausgegeben wurde, bietet Hilfestellung zur Eingruppierung der verschiedenen Analysemethoden und nennt zu evaluierende Parameter.

Analysemethoden werden ihrem Zweck nach unterteilt in Methoden zur Identifikation, zur Gehaltsbestimmung und zum Nachweis von Unreinheiten. Entsprechend dieser Einteilung sind unterschiedliche Parameter bei der Methodenvalidierung zu berücksichtigen. Die wesentlichen Parameter sind: Richtigkeit, Präzision (in Form von Wiederhol- und Vergleichspräzision), Spezifität, Nachweis- und Bestimmungsgrenze (LOD / LOQ), Linearität, Arbeitsbereich und Robustheit.

Richtigkeit / Genauigkeit und Präzision lassen sich am einfachsten über Dartscheiben erklären. Eine Methode kann sehr präzise sein, alle Ergebnisse liegen eng beieinander, befinden aber leider am äußersten Kreis der Dartscheibe. Eine Methode kann eine hohe Richtigkeit aufweisen, alle Ergebnisse zielen ins Schwarze, aber leider ist die Streuung recht groß. Erst wenn eine gute Präzision und eine hohe Richtigkeit gegeben sind, liegen alle Ergebnisse voll im Schwarzen und sind damit dort, wo sie sein sollen. Das Ergebnis ist verlässlich.

Bei Bestimmungen von Unreinheiten ist es sinnvoll, die Nachweis- und Bestimmungsgrenze zu kennen. Dabei ist die Nachweisgrenze für Limit-Tests (Übergang von „man sieht nichts / man sieht etwas“) und die Bestimmungsgrenze für quantitative Analysen relevant (Was ist die niedrigste Konzentration, die ich sicher quantitativ erfassen kann?).

Spezifität ist vor allem für Methoden zur Identifikation unerlässlich. Wenn eine Methode zur Identifikation eingesetzt wird, muss sichergestellt sein, dass sie ausschließlich den nachzuweisenden Analyten in der Probe detektiert und Kreuzreaktionen ausgeschlossen sind. Andernfalls wären falsch positive Ergebnisse die Folge.

Für quantitative Bestimmungen, bei welchen die Konzentration des zu untersuchenden Analyten unbekannt ist und etwas schwanken kann, ist die Linearität der Methode von entscheidender Bedeutung. Eine Methode ist linear, wenn das Messsignal direkt proportional zur Konzentration ist. Mit Hilfe einer Regressionsgeraden lässt sich dann die unbekannte Konzentration des Analyten korrekt berechnen.

Der Arbeitsbereich der Methode lässt sich aus der Linearität, Richtigkeit und Präzision ableiten. Es ist der lineare Bereich zwischen kleinster und größter Konzentration, bei der ein richtiges und präzises Ergebnis erhalten werden kann.

Eine Methode gilt als robust, wenn sie trotz kleiner Abweichungen von der üblichen Durchführung zum gleichen Ergebnis führt. Ein Bespiel aus der Praxis: Bei einer robusten SDS-PAGE bewirkt auch der Einsatz von Fertiggelen unterschiedlicher Hersteller (aber gleicher Konzentration) keinen Unterschied im ermittelten Molekulargewicht des Analyten.