Journal Club: RP-UHPLC-MS versus Peptide-Mapping zur Antikörpercharakterisierung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Einleitung und Hintergrund

Monoklonale Antikörper (monoclonal antibodies, mABs) sind Immunglobuline, die an das gleiche Epitop binden und eine Vielzahl von Anwendungen in der Medizin und im Gesundheitswesen haben. Obwohl therapeutische mABs aufgrund ihrer Spezifität äußerst gefragt sind, sind sie aufgrund ihres Herstellungsprozesses heterogen und stellen damit eine Herausforderung hinsichtlich ihrer Charakterisierung dar. Während der Expression, der Aufreinigung und der späteren Lagerung können enzymatische und chemische Modifikationen wie z.B. Oxidationen oder Glycosylierungen stattfinden. Veränderungen in diesen Modifikationen können die Sicherheit und Wirksamkeit der Antikörper beeinträchtigen. Falls diese Modifikationen als kritische Qualitätsmerkmale (critical quality attributes, CQAs) eingestuft werden, so ist eine vollständige Chrakterisierung regulatorisch vorgeschrieben. Zu ihrer Evaluierung können Stress-Studien angewendet werden.

Aufgrund mangelnder struktureller Auflösung können Größenausschluss- (size exclusion, SE) und Ionenaustauschchromatographie (ion exchange, IEX) nur für die Routineanalytik vollkommen intakter mABs eingesetzt werden. Für eine detailliertere Charakterisierung kann anschließend ein Peptide-Mapping („Peptidkartierung“) der gesammelten Fraktionen angewendet werden. Peptide-Mapping ist eine Methode, bei der die mABs proteolytisch zu Peptiden abgedaut werden, die danach mittels LC(-MS/MS) analysiert werden. Aufgrund einiger Nachteile "normalen" Peptide-Mappings wurde von Zhang et al. eine verbesserte Hochdurchsatz-RP-UHPLC-MS-Methode entwickelt. In diesem Blog-Artikel werden wir uns mit dieser Methode beschäftigen mit einem Fokus auf Stressstudien und Methodenqualifizierung.

 

Methodenoptimierung und Stress-Studien

Die neue Methode umfasst eine limitierte Proteolyse von Immunglobulin G durch das IdeS-Enzym, das spezifisch die schwere IgG-Kette unterhalb der Gelenkregion zwischen den Glycinresten in der Sequenz ELLGGPS spaltet. Nach Reduzierung der Disulfidbrücken resultieren drei verschiedene 25 kDa-Fragmente (leichte Kette (LC); VH-CH1 (Fd) und CH2-CH3 (Fc)). Zur Vermeidung jeglicher Interferenz der C-terminalen Lysin-Variante mit dem Fc-Peak, wurde der mAB zuerst mit Carboxypeptidase B und erst anschließend mit IdeS verdaut. Unter Verwendung zwei verschiedener Antikörper wurden die besten Bedingungen für den Verdau ermittelt. Nach Optimierung der Probenvorbereitung wurde die RP-UHPLC-Methode durch die Optimierung der Parameter Gradient, Durchflussrate, Säulenauswahl und Temperatur entwickelt. Um das Problem einer reduzierten Peakauflösung aufgrund eines erhöhten Totvolumens zwischen dem UV-Detektor und dem Massenspektrometer (MS) zu vermeiden, wurde ein Schlauch minimaler Länge eingesetzt, um den Säulenauslass mit UV und MS zu verbinden. Des Weiteren wurde diese Verbindung direkt zwischen HPLC-Auslass und im MS integriertem Umschaltventil eingebaut.

Die Anwendung der neuen Methode zur Charakterisierung der CQAs eines glykosylierten mABs führte zur Identifizierung recht vieler Varianten. Die wichtigsten beobachteten CQAs umfassten Clipping-Stellen in der leichten und schweren Kette (also Fragmente), nicht-glycosylierte schwere Ketten (non-glycosylated heavy chains, NGHC), die Bildung von Pyroglutaminsäure (PyroE, -18 Da↓), Oxidationen von Methioninresten in der Fc-Region (+ 16 Da↑) und Desamidierungen (typischerweise an Asparaginresten, + 1 Da↑). Des Weiteren wurde die neue Methode für einen Vergleich der CQAs verwendet, die einerseits mit der neuen Methode und andererseits mit traditionellem tryptischen Peptide-Mapping gestresster Proben erhalten wurden. Als Stressbedingungen wurden oxidativer Stress, hoher und niedriger pH-Wert und thermische Belastung angewandt. Es konnte gezeigt werden, dass die neue Methode mit dem Peptide-Mapping vergleichbar bzw. in einigen Punkten überlegen war, wie beispielsweise an einer in beiden Methoden nachgewiesenen UV-induzierten Methioninoxidation, aber z.B. keiner alkalisch-induzierten LC-Deamidierung im Peptide-Mapping gesehen werden kann.

 

Methodenqualifizierung

Die Methode wurde desweitern für die Messung der Fc-Oxidation qualifiziert. Die Parameter Spezifität, Genauigkeit, Präzision, Linearität und Bestimmungsgrenze (limit of quantitation, LOQ) wurden evaluiert.

Die Wiederholpräzision (repeatability) wurde für die Probenvorbereitung und -injektion bestimmt. Für die Injektionswiederholpräzision wurde die Probe 6 Mal aus dem gleichen Vial injiziert und für die Wiederholpräzision der Probenvorbereitung wurden 6 individuell vorbereitete Proben nacheinander analysiert. Für die Auswertung wurde die relative Standardabweichung (RSD) der relativen Peakflächen berechnet. Es wurden Ergebnisse mit einer RSD = 4,6% (Injektionswiederholpräzision) und mit RSD = 2,9% (Wiederholpräzision der Probenpräparation) erzielt.

Die interne Laborpräzision (intermediate precision) wurde in einem Matrixansatz (n = 6) unter Berücksichtigung von drei verschiedenen Tagen, zwei Analysten und zwei Instrumenten sogar unterschiedlicher Hersteller untersucht. Während beide Analysten in ihren individuellen Ergebnissen jeweils eine RSD von <2,5% aufweisen, war die Gesamt-RSD bei <15% bei Auswertung der erhaltenen prozentualen Oxidation.

Linearität und Genauigkeit wurden in einem gemeinsamen Ansatz bestimmt, bei dem sechs Mischungen verwendet wurden, die gestresstes und unbelastetes Material in verschiedenen Konzentrationen enthielten (im Bereich von 0% bis 100%). Der dabei angewandte oxidative Stress wurde durch die Behandlung des Antikörpers mit 0,1% tert-Butylhydroperoxid (tBHP) induziert. Unter Berücksichtigung der relativen Peakfläche der Fc -Oxidation der schweren Kette wurde eine Linearität zwischen 2,6 - 25,8% Peakfläche (R2 = 1) beobachtet, während für die Genauigkeit Wiederfindungsraten (recovery) von 98 bis 100% gefunden wurden.

Die Bestimmungsgrenze wurde als obere (upper limit of quantitation, ULOQ) und untere (lower limit of quantitation, LLOQ) untersucht. Die ULOQ wurde aus den Experimenten zur Bestimmung der Linearitäts und Genauigkeit ermittelt und betrug 25,8%. Da die empirische Bestimmung der LLOQ aufgrund der begrenzten Probenverfügbarkeit nicht möglich war, wurde sie anhand des Signal-zu-Rausch Verhältnisses (Signal-to-Noise, S/N) mit einem Wert von 1,7% berechnet, wobei zur Grundlage gelegt wurde, dass sie um eine 10-faches größer ist als das Rauschen in der Blindprobe.

Darüber hinaus wurde die Spezifität durch die Entfernung der beobachteten terminalen Lysininterferenz durch die Carboxypeptidase B Behandlung sowie durch die mit der UHPLC-MS ermittelte exakte Masse gezeigt.

 

Zusammenfassend scheint die vorgestellte Methode eine gute Alternative zum konventionellen Peptide-Mapping für die Charakterisierung von CQAs therapeutischer Antikörper zu sein. Innerhalb eines 10-minütigen UHPLC-Gradienten wurde eine klare Trennung der Varianten erzielt, was ziemlich schnell ist. Bei der Qualifizierung dieser Methode zur Messung der Fc-Oxidation wurden alle Validierungsparameter gemäß der Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) für quantitative Bestimmungen von Verunreinigen ausgewertet und es wurden ein breiter Linearitätsbereich sowie gute Werte für die Wiederholpräzision und die Genauigkeit erzielt. Eine beobachtete RSD von <15% für die interne Laborpräzision könnte angesichts der Tatsache, dass zwei verschiedene Geräte verschiedener Hersteller verwendet wurden, als akzeptabel angesehen werden. Für die Spezifität wäre zusätzlich ein Placebo-Lauf oder ein Lauf mit verschiedenen oxidativen Stressbehandlungen (vielleicht in verschiedenen Konzentrationen) wünschenswert gewesen. Wenn dies eine wirkliche analytische Methodenvalidierung und nicht "nur" eine Methodenqualifizierung gewesen wäre, wäre einiges an weiterer Dokumentationen erforderlich, wie beispielsweise eine grafische Darstellung der Linearität inklusive Regressionsgleichung, aber dies war nicht im Fokus der Publikation.

Tags: Journal Club Reinheit Methodenqualifizierung Stabilitaetsstudien

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