Journal Club: Validierung einer Dünnschichtchromatographie-Methode zur Gehaltsbestimmung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Einleitung und Hintergrund

Dünnschichtchromatographie in Kombination mit Densitometrie wird für die Analyse verschiedenster Substanzen verwendet, jedoch bislang noch nicht für Clobetasolpropionat (CP). Weltweit wird CP häufig in Form von Salben, Cremes, Lotionen (als pharmazeutische Formulierung) und Kosmetika eingesetzt. Es ist ein Kortikosteroid der Glukokortikoide und wird aufgrund seiner entzündungshemmenden und immunsuppressiven Wirkung bei der Behandlung vieler Hautkrankheiten angewendet. Zur Behandlung wird es entweder allein oder in Kombination mit anderen äußerlich anzuwendenden Mitteln verwendet. Die Bestimmung von CP erfolgt meistens photometrisch oder mit flüssigkeitschromatographischen Methoden wie der RP-HPLC (reversed phase high performance liquid chromatography) oder mittels Massenspektrometrie kombiniert mit HPLC (MS-HPLC). In diesem Blogartikel werden wir die Validierung einer einfachen, von Dolowy et al. entwickelten Dünnschichtchromatographie-Methode zur Quantifizierung von CP in topischen (Anm. d. Red.: zur äußerlichen Anwendung bestimmten) Lösungen diskutieren, die gemäß den von der ICH definierten Methodenkategorien als Assay eingesetzt werden soll.

 

Testprinzip und analytische Methodenoptimierung

Die Dünnschichtchromatographie ist eine Trenntechnik, die auf der relativen Affinität der zu untersuchenden Substanz(en) zur stationären und mobilen Phase beruht. Die Trennung geschieht, wenn die Substanzen unter dem Einfluss der mobilen Phase über die Oberfläche der stationären Phase wandern. Diejenigen Substanzen mit geringerer Affinität zur stationären Phase bewegen sich schneller und umgekehrt, wodurch die Auftrennung der verschiedenen Substanzen erzeugt wird.

Zur Optimierung wurde die Methode wie folgt durchgeführt: CP wurde zusammen mit seiner chemisch verwandten, pharmazeutischen Verunreinigung Clobetasol auf einer vorbeschichteten, voraktivierten DC-Platte unter Verwendung von Kieselgel 60F254 als stationärer Phase aufgetragen. Eine Mischung aus Toluol und Methanol fungierte als mobile Phase. Die Platte wurde für 20 Minuten bei 110°C voraktiviert. Eine 20-minütige Absättigung der DC-Kammer mit mobiler Phase wurde durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit und Peakform der Analyten zu verbessern. Nach dem Zurücklegen einer Gesamtdistanz von 7 cm wurde die Platte bei λ = 246 nm gescannt und die Spots analysiert. In früheren Optimierungsstudien wurden die für die Methode relevanten Parameter bereits evaluiert und als Ergebnis dieser Optimierung konnte eine klare Trennung von CP und Clobetasol beobachtet werden. Der berechnete ΔRF > 0,05 (RF = Retentionsfaktor) zwischen CP und Clobetasol bestätigt die Trennung.

 

Analytische Methodenvalidierung und Diskussion

Die optimierte Methode wurde entsprechend den Anforderungen der ICH-Richtlinie Q2(R1) validiert, wobei die Parameter Spezifität, Linearität, Genauigkeit, Präzision, Robustheit und Nachweis- / Bestimmungsgrenze (LOD / LOQ) betrachtet wurden.

Zur Evaluierung der Spezifität wurde ein Lauf von CP in seiner handelsüblichen topischen Lösung durchgeführt und gegen einen Standard verglichen. Der Spot der Probe konnte bestätigt werden, indem der RF-Wert der Probe mit dem des Standards verglichen wurde. RF ist definiert als die von der zu untersuchenden Substanz zurückgelegte Strecke relativ zu der von der Lösungsmittelfront zurückgelegten Strecke. Die Peaks von Standard und Probe wurden an drei unterschiedlichen Stellen vermessen ("S" bezeichnet den Beginn des Peaks, "M" die Mitte und "E" das Ende des Peaks). Eine gute Korrelation [r (S, M) = 0,998 und r (M, E) = 0,994] ist ein weiterer Hinweis für die Spezifität der Methode. Zusätzlich sind im Chromatogramm der topischen Lösung keine weiteren Peaks zu sehen, so dass eine Interferenz der Hilfsstoffe (wie Carbomer, Isopropanol und Natriumhydroxid) ausgeschlossen werden kann.

Die Linearität wurde als Dreifachbestimmung mit sieben verschiedenen Probenkonzentrationen im Bereich von 0,188 - 5,0 μg/spot durchgeführt. Die Kalibriergerade unter Berücksichtigung dieser Konzentrationen wurde erhalten, indem die Peakfläche gegen die CP-Konzentration aufgetragen wurde. Der Korrelationskoeffizient betrug r > 0,995. Außerdem wurden die Peaks, die mit den verschiedenen CP-Konzentrationen erhalten wurden, in einem sehr schönen 3D-DC-Chromatogramm gezeigt. Des Weiteren wurde eine Grafik der Residuen sowie und andere statistische Daten, wie z.B. die Standardabweichung der Steigung und der Achsenschnittpunkt, präsentiert.

LOQ und LOD wurden bestimmt, um die Sensitivität der Methode zu ermitteln. Dafür wurden die Werte der Linearitätsexperimente verwendet. Die Werte für LOQ und LOD wurden unter Berücksichtigung der Steigung und der Standardabweichung und eines Faktors von 3,3 bzw. 10 berechnet, wobei Werte von 0,061 µg/spot (für LOD) und von 0,186 µg/spot (für LOQ) erhalten wurden.

Die Genauigkeit der Methode wurde durch Spiking-Experimente untersucht. Dabei wurden Mengen, die 50 %, 100 % und 150 % CP der deklarierten Konzentration (= 0,50 mg/ml) entsprachen, zur topischen Lösung gegeben, so dass finale Konzentrationen von 0,75 mg/ml, 1,0 mg/ml und 1,5 mg/ml analysiert wurden. Die Genauigkeit wurde als prozentuale Wiederfindungsrate (% recovery) evaluiert. Die Untersuchung der Proben erfolgte als Dreifachbestimmung unter den eingangs beschriebenen optimierten Bedingungen. Die Wiederfindung betrug 98,7 % und 101 % mit einer relativen Standardabweichung von < 1 %. Dies bestätigt den bereits in den Spezifitätsexperimenten beobachteten nicht vorhandenen Einfluss der Hilfsstoffe.

Die Präzision wurde anhand von Wiederhol- und interner Laborpräzision (intermediate precision) in Form von Tag zu Tag-, Analyst zu Analyst- und Instrument zu Instrument-Präzision untersucht. Mit topischer Lösung in Mengen von 1,0, 1,5 und 2,0 µg/spot CP wurden für die Wiederholpräzision drei Läufe am selben Tag bzw. für die interne Laborpräzision 3 Läufe während einer Woche mit zwei verschiedenen Analysten sowie Platten-Chargen durchgeführt. Zur Bewertung der Präzision wurde der Variationskoeffizient (%CV; = relative Standardabweichung) herangezogen. Bei den Experimenten zur Wiederholpräzision lag die mittlere Wiederfindungsrate zwischen 98,7 % und 101,5 % mit einem prozentualen CV von unter 1 %. Bei der internen Laborpräzision wurden Wiederfindungswerte im Bereich von 98,0 % und 99,3 % mit einem maximalen %CV von 1,17 % erhalten.

Die Robustheit wurde durch Einführung geringfügiger Änderungen hinsichtlich der Kammersättigungszeit (± 10 min), der Plattenaktivierungstemperatur (± 10°C), der Laufstrecke (± 10 mm) und des Volumens der mobilen Phase (± 10 ml) bestimmt. Die gleichen Mengen an CP, wie sie auch für die Präzisionsstudien verwendet wurden, wurden auch bei den Robustheitsexperimenten eingesetzt (1,0, 1,5 und 2,0 μg/spot). Bei allen Konzentrationen betrug der erhaltene %CV weniger als 2 %, was eine gute Robustheit der diskutierten Methode widerspiegelt.

Darüber hinaus wurde die Methode verwendet, um CP in kommerziell erhältlichen topischen Lösungen mit einem deklarierten CP-Gehalt von 0,50 mg/ml zu bestimmen. Zur Analyse wurde eine Endkonzentration von 0,25 mg/ml, was 1,25 µg/spot entspricht, eingesetzt. Gemäß der USP-Monographie darf der CP-Gehalt in topischer Lösung nicht größer als 110 % und nicht kleiner als 90,0 % des deklarierten Gehalts sein. Der mittlere Gehalt von sechs Bestimmungen lag bei 0,49 ± 0,02 mg/ml (mit einem %CV von < 2,0), was 98 % des deklarierten Gehalts entspricht, also gut im Bereich von 90 % und 110 % liegt.

 

Zusammenfassend ist die vorgestellte Dünnschichtchromatographie-Methode gut geeignet, um als Routineanalytik zur quantitativen Bestimmung von CP in pharmazeutischen Formulierungen eingesetzt zu werden, da alle untersuchten Validierungsparameter gute Ergebnisse gezeigt haben. Für einen Assay ist die Auswertung von LOD / LOQ gemäß der ICH-Richtlinie nicht erforderlich. Dass dies in dieser Veröffentlichung trotzdem gemacht wurde, könnte der Tatsache geschuldet sein, dass die Methode auch in der Lage ist, zwischen CP und seiner Verunreinigung Clobetasol zu unterscheiden (wie im obigen Abschnitt zur Methodenoptimierung beschrieben). Falls diese Methode jedoch als Reinheitstest eingesetzt werden sollte, wäre es besser gewesen, für die Beurteilung von LOD / LOQ die Verunreinigung Clobetasol anstatt CP zu verwenden.

Darüber hinaus wird in dieser Veröffentlichung nichts über den Arbeitsbereich der Methode gesagt. Der Arbeitsbereich kann jedoch basierend auf den Linearitäts-, Genauigkeits- und Präzisionsexperimenten definiert werden. So wurde für die Linearität ein ziemlich breiter Bereich, bei der Genauigkeit relativ hohe Konzentrationen und bei der Präzision (sowie den Robustheitsexperimenten) 1,0 bis 2,0µg/spots analysiert. Das Bestätigungsexperiment mit der kommerziellen Lösung wurde mit 1,25 μg/spot durchgeführt. Daraus könnte man jetzt einen Arbeitsbereich von 1,0 bis 2,0 μg/spot ableiten. Dies würde gut mit der untersuchten Präzision und Linearität übereinstimmen, aber hinsichtlich der Genauigkeit wären Experimente, die diesen Bereich abgedeckt hätten, empfehlenswerter gewesen. Da jedoch von den Autoren nichts über den anzuwendenden Arbeitsbereich gesagt wird, ist dies nur unsere Schlussfolgerung.

In Bezug auf die Präsentation der Arbeit in dieser Publikation sollte erwähnt werden, dass die Autoren, sofern angebracht, sehr schöne farbige 3D-Chromatogramme gezeigt, sowie Erklärungen für die Berechnung der Trennfaktoren inklusive der mathematischen Gleichungen geliefert und die Daten in eingängigen, sehr übersichtlichen Tabellen veranschaulicht haben. Dadurch hat es Spaß gemacht, diese Publikation zu lesen. Von untergeordneter Bedeutung ist, dass die Autoren sich auch für die Beurteilung ihrer Werte auf die ICH Q2(R1) bezogen haben, in einer Weise als wären dort für jeden Parameter auch einzuhaltende Grenzwerte genannt, was nicht den Tatsachen entspricht.

Tags: Journal Club Methodenvalidierung ICH Q2(R1) Gehalt

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