Wie bestimme ich die LOD mit Hilfe der Kalibrierfunktion?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im Rahmen von Methodenvalidierungen ist es bei Reinheitstests erforderlich, die Nachweisgrenze (Limit of detection, LOD; oder auch DL = detection limit) bzw. die Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) zu ermitteln. Dies kann z.B. unter Anwendung der Kalibriergeraden erfolgen und wird dann in der Literatur als „Kalibriergeradenverfahren“ bezeichnet.

Am Beispiel der Nachweisgrenze werden dafür von der Validierungsguideline ICH Q2(R1) in Abschnitt 6.3 bzw. 6.3.2 folgende Vorgaben gemacht:

Zur Berechnung gilt die Formel: DL = 3,3 x σ / S. Dabei ist S die Steigung der Kalibriergerade und σ die Standardabweichung der Reaktion (response). Und genau diese Standardabweichung darf auf verschiedene Arten ermittelt werden, u.a. mit Hilfe einer Kalibriergerade:

„A specific calibration curve should be studied using samples containing an analyte in the range of DL. The residual standard deviation of a regression line or the standard deviation of y-intercepts of regression lines may be used as the standard deviation.“.

Das klingt interessant. Da uns dies in Kundenprojekten noch nicht untergekommen ist, wollte ich der Frage einmal nachgehen, wie man das eigentlich praktisch macht. Das sollte ja nicht so schwer sein, dachte ich. Doch ich wurde eines Besseren belehrt, denn an dieser Frage scheiden sich die Geister. Im Zuge der Recherche bin ich auf vielfältige Möglichkeiten gestoßen.

 

Eine oder ganz viele Geraden und was steckt dahinter?

In allem einig und auch von der Guideline vorgegeben ist die Tatsache, dass dafür nicht die „normale“ Kalibriergerade über den Messbereich (wie sie in der Linearitätsbestimmung ermittelt wurde) genommen werden sollte, sondern eine, die den unteren Bereich in der vermuteten Umgebung der Nachweisgrenze umfasst. Dies hat den einfachen mathematischen Hintergrund, dass bei der Verwendung der „normalen“ Kalibriergerade, welche ja deutlich höhere Werte umfasst, der Schwerpunkt der Gerade nach weiter oben verschoben ist und eine daraus ermittelte Nachweisgrenze entsprechend einen viel zu hohen Wert aufweisen würde. Daher ist es empfehlenswert, als höchste Konzentration nicht mehr als das 10fache der vermuteten Nachweisgrenze einzusetzen [1, 2].

Ok, also mit einer Gerade im Bereich des LOD. Ja, aber wirklich nur mit einer Gerade? Und mit wie vielen Konzentrationen?

Diesbezüglich existieren die unterschiedlichsten Meinungen. Mathematisch möglich wäre es mit nur einer Geraden; aber auch zwei oder mehrere Geraden oder mehrere Injektionen finden Anwendung. Bevor wir uns diese Möglichkeiten einmal an praktischen Beispielen ansehen, sollten wir jedoch erst mit dem mathematischen Hintergrund beschäftigen.

Einer Regressionsgeraden (y = mx + c) liegt die Methode der kleinsten Fehlerquadrate zu Grunde. Da nicht alle Datenpunkte zu 100% auf der Gerade liegen, bildet sie den bestmöglichen Ausgleich daraus ab. Entsprechend existiert eine ihr innewohnende Standardabweichung (manchmal auch als Standardfehler bezeichnet). Visualisiert sieht das so aus:

Unter Berücksichtigung der 3,3fachen Standardabweichung können wir den Y-Achsenabschnitt des LOD mit folgender Formel berechnen: yLOD = 3,3 σ + c und die LOD-Konzentration (x) mit x = (yLOD − c) / m. Kombiniert ergibt das x = 3,3 σ / m, womit wir die oben von der ICH vorgegebene Formel hergeleitet haben.

Mathematisch gesehen gelten folgende Voraussetzungen bei der Anwendung des Kalibriergeradenverfahrens [2]:

  • im Bereich des vermuteten LOD ist Linearität gegeben (sonst macht das ja gar keinen Sinn)
  • die Messwerte (response / signal) der Proben sind normal verteilt und voneinander unabhängig
  • im Kalibrierbereich besteht Varianzenhomogenität.

Da in der Praxis diese Bedingungen nicht unbedingt zu 100% eingehalten werden (können), ist zu bedenken, dass dem ermittelten Wert eine gewisse Ungenauigkeit zu Grunde liegen kann.

 

Ein Praxisbeispiel zur Veranschaulichung

Schauen wir uns das Ganze nun einmal praktisch an. Dafür wurden von einem realen Beispiel ausgehend Werte für 4 Geraden mit jeweils 5 Messpunkten mit je 3 Replikaten im Bereich des vermuteten LOD konstruiert. Bei dem realen Experiment wurde ein zuvor während der Methodenentwicklung ermitteltes LOQ der RP-HPLC Methode mit dem Signal-to-Noise-Verfahren verifiziert. Dieses lag bei 6 µg/mL. Daraus wurde das vermutete LOD mit 1,8 µg/mL abgeleitet.

Die folgende Tabelle zeigt die Mittelwerte der „Messwerte“ dieser konstruierten Experimente:

  Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 Experiment 4
 Konz. [µg/mL] Area [µAU*s]   
 1,8 25364 25776 27016 25566
 4,2 68407 68527  69041 68568
 6,6 108226  108239 109760 108342
 10,8  173944  173497 175987  173747
15,0 235865 235474  247231  235686

Diese Messwerte wurden einer Regressionsanalyse unterzogen und die Regressionsgeraden mit Steigung m, Y-Achsenabschnitt c, Bestimmtheitsmaß R2 sowie Standardfehler des Y-Achsenabschnitts und der Regressionsgerade an sich bestimmt. Dafür gibt es in Excel verschiedene Möglichkeiten. Eine ist die Anwendung der RGP-Funktion, welche als etwas tricky empfunden werden kann. Eine andere ist der Weg über den Reiter „Daten“ → „Datenanalyse“ → Regression → Auswahl der zu untersuchenden Daten und Anklicken des Feldes „Residuen“→ Anklicken von „ok“, wonach ein Ausgabefenster mit einer Vielzahl statistisch interessanter Informationen erscheint. Darunter sind dann natürlich auch die Infos zur Standardabweichung der Regressionsgerade an sich (im Feld B7) und die des Y-Achsenabschnittes (im Feld C17). Zur ausführlichen Erklärung dieser Funktionen seien dem geneigten Leser YouTube-Videos ans Herz gelegt ;-)

Folgende Ergebnisse wurden erhalten:

  Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 Experiment 4
Regressionsgerade y=15878x+416 y=15814x+849 y=16562x-1389  y=15844x+699
R2  0,9987 0,9988 0,9997 0,9987
Steigung m  15878 15814  16562 15844
Y-Achsenabschnitt c 416 849  -1389 699
SDY-Achsenabschnitt 2943 2849 1429 2937
SDRegressionsgerade 3443 3333 1672 3436

(Kleine Anmerkung an Rande: Interessanterweise können die so berechneten Werte für das Bestimmtheitsmaß R2 von denen in einer Abbildung angezeigten abweichen… aber ist wieder eine andere Geschichte.)

Mit den so erhaltenen Werten für die Standardabweichung des Y-Achsenabschnittes bzw. der Regressionsgerade an sich kann nun gemäß der bekannten Formel LOD = 3,3 SD / m die LOD berechnet werden:

  Experiment 1 Experiment 2 Experiment 3 Experiment 4
LOD in µg/mL berechnet mit SDY-Achsenabschnitt 0,61  0,59 0,28  0,61
LOD in µg/mL berechnet mit SDRegressionsgerade  0,72 0,70  0,33  0,72

In diesem konstruierten Beispiel weichen die Ergebnisse - abgesehen von Experiment 3 - nicht sehr stark voneinander ab. Für die Realität ist es sicherlich empfehlenswert, mehr als nur eine Gerade auszuwerten (ob es 4 sein müssen, sei mal dahingestellt) und bestenfalls die Experimente auf verschiedene Tage und Tester aufzuteilen, um wirklich unabhängige Ergebnisse zu generieren. Inwiefern dieser Aufwand gerechtfertigt ist, bleibt jedem selbst überlassen.

Interessant ist bei der Betrachtung der Ergebnisse auch die Feststellung, dass diese mit einem Mittelwert von 0,66 µg/mL (unter Ausschluss von Experiment 3) deutlich niedriger sind als das eingangs vermutete LOD mit 1,8 µg/mL. Dies mag aber bereits daran liegen, dass zur Bestimmung der LOQ ein anderes Bestimmungsverfahren herangezogen wurde (siehe auch letzte Abschnitt).

Die im Bespiel angewandte Anzahl an Geraden und Messpunkten erhebt keineswegs den Anspruch darauf, dass eine LOD-Bestimmung genauso gemacht werden müsse. Ganz im Gegenteil, sie soll als Diskussionsstartpunkt fungieren, da mir im Zuge der Recherche auch andere Möglichkeiten begegnet sind. So sind z.B. auch 2 Geraden (eine oberhalb und eine unterhalb des vermuteten LODs) eine interessante Option und im Guidance Dokument für die LOD- und LOQ-Bestimmung von Verunreinigungen in Futter- und Nahrungsmitteln wird zudem eine andere Berechnung für die dort aufgeführte Vorgehensweise angewandt [2]. Natürlich ist ein solches Dokument nicht für Arzneimittel verbindlich, kann aber möglicherweise ebenfalls eine Option zur Orientierung darstellen.

 

Unterschiedliche Bestimmungsverfahren führen zu verschiedenen Ergebnissen

Ein kurzer Blick in zwei Publikationen [3, 4] zeigt, dass sich die Ergebnisse unterscheiden, je nachdem welches Verfahren zur Bestimmung von LOD und LOQ (visuelle Prüfung, Signal-to-Noise oder das in diesem Blogbeitrag beschriebene Kalibriergeradenverfahren) angewandt wird. Selbst innerhalb des Kalibriergeradenverfahrens können recht unterschiedliche Ergebnisse erhalten werden, je nachdem ob die Standardabweichung des Y-Achsenabschnitts oder die der zu Grunde liegenden Regressionsgerade verwendet wird.

Aus regulatorischer Sicht ist keine Begründung für das angewandte Bestimmungsverfahren notwendig. Vom wissenschaftlichen Standpunkt erachte ich das als fragwürdig.

Was sind Eure Erfahrungen und was ist euer Standpunkt?

 

Literatur:

[1] Kromidas S., 2011, Validierung in der Analytik, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, Weinheim, ISBN 978-3-527-32939-7

[2] Wenzl T. et al., 2016, Guidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Food

[3] Saadati N. et al., 2013, Limit of detection and limit of quantification development procedures for organochlorine pesticides analysis in water and sediment matrices, Chem Cent J. 7(1):63

[4] Şengül Ü., 2016, Comparing determination methods of detection and quantification limits for aflatoxin analysis in hazelnut. J Food Drug Anal. 24(1):56-62.

 

P.S.: Die hier exemplarisch für die Nachweisgrenze beschriebene Abhandlung lässt sich natürlich unter Anwendung der entsprechenden Formel auch auf die Bestimmungsgrenze übertragen.

Tags: LOD Methodenvalidierung Lineare Regression Nachweisgrenze

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