Methodenvalidierung

Ermittlung der Genauigkeit und Präzision an der Bestimmungsgrenze

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Vor einiger Zeit hat mich als Reaktion auf den Blogbeitrag „Wie bestimme ich die LOD mit Hilfe der Kalibrierfunktion?“ die Anfrage erreicht, wie man denn bei Methodenvalidierungen für Arzneimittel die Genauigkeit und die Präzision an der Bestimmungsgrenze (limit of quantitation, LOQ) ermitteln könnte.

Stellen wir uns vor, wir haben eine HPLC-Methode, mit der wir Verunreinigungen quantifizieren wollen. Während der Methodenentwicklung haben wir im Rahmen einer Feasibility Study bereits eine Abschätzung der Bestimmungsgrenze gemacht. In unserem Beispiel sagen wir, wir wissen, dass sie bei ca. 0,2% der Arbeitskonzentration liegt. Die Methodenvalidierungsguideline ICH Q2(R1) gibt uns vor, dass die Bestimmungsgrenze durch eine geeignete Anzahl an Proben mit einer Konzentration nahe oder gleich der Bestimmungsgrenze validiert werden soll („The limit should be subsequently validated by the analysis of a suitable number of samples known to be near or prepared at the quantitation limit.“). Entsprechend könnten wir für die Validierung der Methode jetzt z.B. 6 individuell hergestellte 0,2%-Verdünnungen der Probe injizieren und mit Hilfe des Signal-to-Noise-Verfahrens hinsichtlich der Bestimmungsgrenze auswerten. Dabei stellen wir dann hoffentlich fest, dass das Signal zu Rausch Verhältnis (S/N) aller injizierten Proben größer als 10 ist, womit wir ein zuvor im Validierungsplan definiertes Akzeptanzkriterium erfüllt haben.

Das Konfidenzintervall in der Methodenvalidierung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im heutigen Blogbeitrag wollen wir uns einmal mit der Rolle und den Anwendungsmöglichkeiten von Konfidenzintervallen (Synonym: Vertrauensintervall, Vertrauensbereich) bei der Methodenvalidierung beschäftigen.

 

Was wissen wir

In einem früheren Blogartikel haben wir beschrieben, was ein Konfidenzintervall ist. Wir wissen also, dass ein Konfidenzintervall einen Bereich umfasst, in dem sich bei unendlicher Messwiederholung mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit (dem Konfidenzniveau) die wahre Lage eines Parameters, wie z.B. des Mittelwerts, befindet. Er zielt damit auf die Präzision der Messung ab.

Verifizierung einer Arzneibuchmethode am Beispiel des LAL-Tests

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Für die Freigabe von Arzneimitteln ist nicht nur entscheidend, dass der Wirkstoff in angegebener Konzentration und Wirksamkeit vorhanden ist, sondern auch, dass das Arzneimittel möglichst wenig Verunreinigungen aufweist. Bei sterilen, z.B. parenteral verabreichten Arzneimitteln sollten nicht nur keine Keime mehr im Produkt vorhanden sein, sondern auch keine bakteriellen „Rückstände“. Darunter sind z.B. fieberauslösende Bestandteile der Zellmembran zu verstehen, sogenannte Endotoxine. Diese können mit verschiedenen Methoden nachgewiesen werden, eine davon ist der Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Test.

Die Durchführung dieses Tests ist in den Arzneibüchern beschrieben (Ph. Eur. 2.6.14 und USP <85>) und kann auf verschiedene Weise erfolgen, z.B. als quantitativer photometrischer Test oder als Limit-Test / Grenzprüfung per Gel-Clot Technik. Bei einem quantitativen Test wird ein konkretes Ergebnis mit einem Zahlenwert erhalten, bei einem Limit-Test kann nur die Aussage getroffen werden, ob Endotoxine in einer Konzentration oberhalb eines Grenzwerts in der Probe vorhanden sind oder nicht.

Wie bestimme ich die LOD mit Hilfe der Kalibrierfunktion?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Im Rahmen von Methodenvalidierungen ist es bei Reinheitstests erforderlich, die Nachweisgrenze (Limit of detection, LOD; oder auch DL = detection limit) bzw. die Bestimmungsgrenze (Limit of quantification, LOQ) zu ermitteln. Dies kann z.B. unter Anwendung der Kalibriergeraden erfolgen und wird dann in der Literatur als „Kalibriergeradenverfahren“ bezeichnet.

Am Beispiel der Nachweisgrenze werden dafür von der Validierungsguideline ICH Q2(R1) in Abschnitt 6.3 bzw. 6.3.2 folgende Vorgaben gemacht:

Ausreißer bei Methodenvalidierung und Transfer

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Zwei Beispiele

Beginnen wir mit einem Beispiel. Während der Validierung einer analytischen Methode soll die Linearität evaluiert werden. Dazu werden 5 Konzentrationen mit je 3 Replikaten untersucht (um neben der Linearität auch die Genauigkeit in einem Ansatz zu erschlagen). Bei der Konzentration, die 120% der Testkonzentration entspricht, ist ein Wert deutlich höher als die beiden anderen. Dennoch kann auch unter Berücksichtigung dieses Wertes das Akzeptanzkriterium eingehalten werden. Jetzt stellt sich die Frage, was man tun soll. Muss man die gesamte 120%-Konzentration mit allen 3 Replikaten wiederholen, kann man den auffälligen ausschließen und nur den Mittelwert aus den beiden anderen bilden oder muss man gar alle Experimente zur Linearität wiederholen?

Was bedeuten eigentlich „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“?

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Eine Anfrage über unsere Homepage hat mich dazu veranlasst, mich einmal intensiver mit den Begriffen „dilution integrity“, „dilution linearity“ und „parallelism“ zu beschäftigen. Sie alle entstammen dem Bereich der Validierung bioanalytischer Methoden, also solcher, bei denen eine biologische Probe wie beispielsweise menschliches oder tierisches Blut oder Urin untersucht wird. Solche Analysen sind im Rahmen präklinischer und klinischer Studien bei der Entwicklung von Arzneimitteln notwendig. Die dafür anzuwendenden Analysemethoden wie z.B. LC- oder GC-MS oder Ligandenbindungsassays (LBA) sind natürlich vor ihrem Einsatz zu validieren. Im Gegensatz zur Validierung analytischer Methoden für bereits zugelassene Arzneimittel existiert derzeit keine harmonisierte Richtlinie bezüglich der Anforderungen für die Validierung bioanalytischer Methoden. So haben die unterschiedlichen Behörden ihre eigenen Richtlinien herausgegeben, siehe auch unseren Blogartikel dazu. Entsprechend kann es leicht zu Verwirrungen kommen. In diesem Blogartikel möchten wir die 3 Begriffe genauer erklären und gegeneinander abgrenzen.

Revision der Validierungsrichtline ICH Q2(R1) geplant

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Wie im Sommer dieses Jahres und jetzt im November etwas detaillierter bekannt wurde, wird die von der ICH herausgegebene Richtlinie zur Validierung analytischer Methoden überarbeitet werden. Die Inhalte der im November 2005 zusammengefassten Richtlinie entstammen zwei zuvor separaten Richtlinien, die vor mehr als 20 Jahren veröffentlicht wurden. Der Beschluss zur Revision der Validierungsguideline ICH Q2(R1) ist im Juni beim ICH-Meeting getroffen worden zusammen mit der Entscheidung der Erstellung einer neuen Richtlinie zur Methodenentwicklung (ICH Q14). Noch ist unklar, ob dies zwei eigenständige Dokumente sein werden, oder ob eine kombinierte Richtlinie resultieren wird, da eine mögliche Kombination durch das Expertenkomitee geprüft werden soll.

Ableitung der Genauigkeit aus der Linearität – Weg 2: Wiederfindung

Geschrieben von Dr. Janet Thode am . Veröffentlicht in Methodenvalidierung

Nachdem wir im letzten Blogbeitrag den ersten Lösungsweg (--> Normalisierung) für die Ermittlung der Genauigkeit bei Methodenvalidierungen, bei denen es keine Unreinheiten zum Spiken oder Alternativmethoden gibt, betrachtet haben, wollen wir uns heute den zweiten Lösungsweg ansehen.

Wir bleiben bei unserem Beispiel vom letzten Mal, wo eine SE-HPLC zur Bestimmung der Reinheit eingesetzt werden soll. Die Verunreinigungen werden als Summe der Nebenpeaks angegeben, während es sich bei dem Hauptpeak um unser gewünschtes Produkt handelt. Unser grundsätzlicher Ansatz besteht wie letztes Mal darin, die Genauigkeit aus der Linearität abzuleiten, da dies bei gegebener Spezifität (dies setzten wir wieder voraus) und Präzision entsprechend der Validierungsrichtlinie ICH Q2(R1) erlaubt ist.

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